Histoire du COVID-19 – chapitre 7 - Partie 1 : Manipulation des virus par enzyme de restriction et PCR

Où l'on apprend que l'on sait depuis 2002 manipuler le génome d'un coronavirus sans laisser de trace et que l'Institut Pasteur ne dit pas tout sur ses brevets et le reste.

Sans que la majorité d'entre nous en fût consciente le prix Nobel de chimie de 2020 nous a projeté officiellement dans un monde de science-fiction. Cependant, la manipulation d'un génome complet de coronavirus était déjà possible depuis l'année 2002, grâce à des techniques simples et performantes dont certaines permettent de ne pas laisser de trace.

Première création d'un coronavirus chimérique synthétique en 2000

Il y a tout juste 20 ans, Lili Kuo, affiliée au David Axelrod Institute - New York State Department of Health, en collaboration avec le groupe de recherche de J.M. Rottier à l'Université d'Utrecht (Pays-Bas), publiait le résultat de travaux séminaux qui allaient devenir, dans les années suivantes, la base conceptuelle des recherches que Shi Zheng Li a poursuivi sur la transmissibilité des coronavirus de chauves-souris à l'homme.  Le titre de l'article décrivant cette première mondiale en terme de manipulation de virus laisse peu de place au doute : « Redéfinir l'hôte-cible d'un coronavirus par échange de l'ectodomaine de sa protéine S : franchissement de la barrière cellulaire des espèces hôtes. »

Ils avaient construit un mutant du coronavirus de l'hépatite murine (MHV) dans lequel une partie de la protéine S (ectodomaine ou sous-unité S1 située à l'extérieur de la membrane du virus) avait été remplacée par le domaine équivalent mais très dissimilaire (84 % de divergence) de la protéine S du coronavirus de la péritonite infectieuse du félin (PIF du chat). Il faut noter que ces 2 coronavirus sont hautement spécifiques de leurs hôtes naturels, empêchant la contamination entre les deux espèces. Le virus chimérique artificiel obtenu (fMHV) avait acquis la capacité d'infecter les cultures cellulaires félines et en même temps avait perdu celle d'infecter les cultures cellulaires de tissus murins. Ces chercheurs avaient ainsi démontré, par échange réciproque de facteurs moléculaires infectieux, le concept que la spécificité des coronavirus pour un hôte particulier était déterminée par l'interaction de la protéine S avec le récepteur cellulaire de l'hôte. De plus, ils avaient identifié la région responsable de cette spécificité comme étant une séquence d'environ 70 acides aminés située à l'extrémité C-terminale de la sous-unité S1, appelée motif de liaison au récepteur (RBM, voir chapitre 6, partie 4). Ces résultats sont fondateurs de ce qui s'est ensuite passé depuis 20 ans.

Il est important de mentionner ici que les auteurs avaient noté cependant, que le virus chimérique recombinant fMHV semblait être moins infectieux que le virus souche naturel MHV. Ils ont attribué ce « problème », entre autre, à la possibilité que le système de transcription du virus murin récepteur de la manipulation ne soit pas adapté de façon optimale à la réplication de la protéine S féline chimérique. Cela aurait engendré un nombre moins élevé de copies du gène S au cours de la réplication et donc un pouvoir infectieux diminué. Une autre hypothèse était que la protéine S hybride construite ne s'intégrait pas aussi bien dans la membrane du virus murin que la protéine S murine, déstabilisant aussi les capacités infectieuses du virus mutant. Cet aspect des choses est très important car il montre que l'on ne peut pas réellement fabriquer un organisme optimal de novo, directement par assemblage d'éléments distincts, même provenant de la même espèce.

A une autre échelle, ce phénomène est comparable à celui de rejet dans les greffes ou les transfusions sanguines. Pour qu'un fonctionnement soit optimal il faut une adaptation parfaite que seule la pression évolutive peut engendrer. Malheureusement, dans le cas des virus on peut par passages répétés, dans dans une culture cellulaire ou chez un mammifère hôte (voir chapitre 2), forcer l'adaptation. D'ailleurs, Kuo et al. décrivent comment d'autres études ont réussi à forcer le passage inter-espèces du virus MHV de cette manière, le virus gardant la capacité d'infecter les souris. Ce dernier point est à notre avis crucial dans la compréhension de la genèse du Covid-19, car il montre qu'une exposition répétée à un coronavirus spécifique d'une espèce (les chauves-souris) permet le franchissement de la barrière inter-espèce sans que le virus ne perde sa capacité par rapport à l'espèce initiale. Donc, l'exposition répétée des trafiquants des marchés avec des animaux sauvages comme des chauves-souris, et l'exposition des animaux entre eux, est bel et bien un mécanisme de franchissement des espèces avec acquisition de transmission inter-humaine, inter-animale et humaine-animale qui permet ensuite, la circulation et la recombinaison de nombreuses souches de coronavirus. Ce mécanisme est plus lent dans les marchés que dans des cultures cellulaires à haute concentration. Mais le principe est le même, une promiscuité permanente lui permet d'avoir lieu sur quelques mois ou quelques années au plus.     

Avant 2012, on manipulait un génome par recombinaison ciblée d'ARN

La manipulation de virus consiste à en faire la rétro-ingénierie, c'est-à-dire à ré-assembler des éléments fractionnés, dont certains ont été modifiés à dessein, par génie génétique. Une difficulté supplémentaire avec les virus à ARN est que certaines manipulations doivent passées par l'intermédiaire d'un ADN complémentaire (ADNc), dit recombinant, codant le génome du virus alors que le virus à ARN ne possède jamais de code ADN à son état naturel. A l'époque de Kuo et al., les procédés de microbiologies utilisés étaient très complexes dans leur conception et également dans leur mise en œuvre, ce qui nécessitait de longs efforts s'étalant sur des années. Les expériences de génie génétique publiées par de Kuo et al. en 2000 se sont déroulées sur une période de 2 ans, suivant une phase d'élaboration en 1997 d'un premier virus génétiquement préparé pour permettre les expériences de recombinaison d'ARN ciblant la protéine S des virus félin et murin.

Ils ont utilisé la mutagenèse dirigée qui fait appel à l'utilisation d'un plasmide dans lequel on insère artificiellement une séquence modifiée d'un gène ou d'une partie d'un gène. Les plasmides sont de l'ADN circulaire (pouvant dépasser une longueur de 50 kb) présent naturellement dans les bactéries. Leur rôle naturel est de conférer aux bactéries un pouvoir de défense car ils encodent des enzymes permettant la lyse des antibiotiques. Les plasmides sont au cœur des procédés de génie génétique. Ré-injectés après manipulations dans les bactéries ils permettent l'expression de protéines exogènes manipulées, facilement et en grande quantité, engendrant de multiples applications. Mais le champ d'application le plus critique qui a été ouvert était la possibilité de manipuler des virus.

Cependant, en 2000, la taille très grande des génomes des coronavirus, environ 30 000 nucléotides (nt). les rendait inappropriés pour des manipulations du type mutagenèse dirigée. Les nucléotides sont 4 bases azotés : A, G, C, T dans le cas de l'ADN et A, G, C, U dans le cas de l'ARN, qui sont les briques élémentaires constituant les génomes (voir chapitre 5). Kuo et al. ont contourné le problème en utilisant la propriété naturelle de recombinaison des coronavirus. Ils ont exprimé dans une culture de bactéries un virus MHV muté (Alb4), qui avait perdu sont gène N (NDA, l'absence de la protéine N empêche la nucléocapside de se former et expose l'ARN du virus au cytoplasme bactérien ce qui permet les réarrangements), en même temps qu'un vecteur donneur de l'ARN de la protéine S féline plus la partie restante du virus jusqu'à l'extrémité 3' avec le gène N intègre. Le processus de recombinaison a généré aléatoirement des virus mutants qui ont pu être séparés ensuite entre ceux actifs sur les cellules murines et ceux actifs sur les cellules félines. Ensuite, on pouvait vérifier que ceux actifs sur les cellules félines ne l'étaient pas sur les cellules murines.

Dès le début des années 1980, on savait faire la manipulation moléculaire des virus à ADN en passant par le clonage moléculaire d’une partie ou de la totalité du génome viral dans un plasmide bactérien. Une difficulté pour les virus à ARN provenait du fait que l’ARN ne peut pas être cloné directement dans un plasmide qui ne peut contenir que de l'ADN. Cet obstacle a commencé à être levé à partir de 1978 avec le virus bactériophage Qβ. En 1981, le clonage d’un ADNc de l’ARN du poliovirus a été effectué dans un plasmide bactérien. L'ARN du virus a été transcrit en ADNc par une transcriptase inverse et puis incorporé dans le plasmide bactérien, par l'intermédiaire d'enzymes de restriction et de ligases qui coupent le plasmide et le recollent ensuite quand l'ADNc s'y est introduit. L'introduction de l'ADNc avait été réalisé grâce à une modification chimiquement préalable, à chacune de ses extrémités, pour y introduire un site de clivage identique (d'une longueur de quelques nucléotides) à celui permettant d'ouvrir le plasmide. En effet, des petites séquences d'ADN contenant un ou plusieurs sites de clivage peuvent être synthétisées chimiquement à volonté. Ensuite, en faisant agir une enzyme de restriction spécifique sur l'ADNc, cela a permis de créer des coupures complémentaires avec des côtés spécifiques à ceux engendrés par la coupure dans le plasmide. Les extrémités de l'ADNc ayant donc une affinité pour les extrémités complémentaires de la coupure se sont assemblées naturellement et ont refermé le plasmide en s'y insérant. La finalisation des jointures a été assurée par une ligase. Ce résumé schématique de l'expérience ne rend pas compte d'un grand nombre de difficultés techniques nécessitant de multiples étapes dans le construction et l'insertion de l'ADNc dans le plasmide. Elles sont dues à la difficulté d'utiliser les enzymes de restriction correctement et en particulier obtenir l'insertion dans la bonne orientation. A noter qu'à présent, pour obtenir la bonne orientation du premier coup on fait appel à 2 sites de restrictions distincts à chaque extrémité de l'ADNc et on coupe le plasmide en 2 endroits portant les mêmes sites de restriction. Les plasmides synthétiques modernes intègrent des foultitudes de sites de restriction.

Le plasmide, augmenté de l'ADNc du virus, a été alors injecté (transfection) dans des cultures de cellules humaines et de primates et sa transcription par l' ARN-polymérase cellulaire pouvait engendrer un ARN messager viral complet capable d’engager un cycle productif dans les cellules transfectées. La voie était ainsi ouverte pour la manipulation de n'importe quel virus à ARN. Depuis, les techniques se sont considérablement améliorées.

Avec les plasmides, les enzymes de restriction sont un outil incontournable essentiel dans les manipulations génétiques. Elles sont produites naturellement par des bactéries comme mécanisme de défense contre les infections par les bactériophages, des virus spécifiques des bactéries. Lorsque le virus injecte son ADN dans la bactérie, celui-ci est coupé par l'enzyme de restriction au niveau de ses sites spécifiques d'une longueur de 4 à 10 paires de bases. Il en existe un grand nombre répertorié, toutes spécifiques à une séquence particulière. Le hasard fait que l'on peut retrouver dans tous les génomes jusqu'aux organismes évolués, comme les mammifères, des sites de clivages répartis aléatoirement, ouvrant la possibilité de manipulation d'insertion ou d'échange de séquences ADN.

Cependant, leur répartition est aléatoire et suivant le nombre de nucléotides reconnus, les enzymes de restriction coupent l'ADN plus ou moins fréquemment. Par exemple, les enzymes de restriction MspI (CCGG) et BamHI (GGATCC) coupent en moyenne l'ADN toutes les 256 (4⁴) et 4096 (4⁶) paires de bases. Cela restreint considérablement les possibilités d'action ciblée à volonté car on s'expose à couper l'ADN cloné en plusieurs endroits au lieu d'un seul. Cependant, la technique PCR permet de corriger ces problèmes en mutant les sites de restrictions indésirables et en restaurant la séquence originale par la suite par manipulation inverse. Des manipulations par un autre outil beaucoup plus complexe à mettre en œuvre à base de protéines à doigt de zinc peuvent également avoir lieu. Ces protéines reconnaissent spécifiquement des codons (groupe de 3  paires de base) et il y a en existe pour toutes les possibilités. Une fois assemblée et couplées à d'autres enzymes dans un complexe supramoléculaire on peut arriver à manipuler un endroit du génome. Mais la mise en œuvre en terme de temps et de savoir faire technique est plus que décuplée.

Par contre, des mutations ponctuelles peuvent être introduites très facilement depuis les années 1990 dans des génomes viraux par la technique PCR (réaction en chaîne par polymérase), une technique dont les Français ont découvert à leur détriment l'existence au cours de l'épidémie de SARS-Cov2. Cette technique très souple d'utilisation permet par exemple, comme nous l'avons dit dans le paragraphe précédent, de protéger un site de restriction à un endroit du génome pour empêcher son clivage.

Nous devons ici ouvrir une parenthèse indispensable pour l'information du public. La façon dont la PCR est utilisée dans les tests mis en place par les autorités de santé permet de repérer la présence d'une séquence complémentaire d'une séquence amorce d'une longueur très réduite (20 à 30 kb) par rapport à la longueur d'un génome intégral de virus. Elle ne détecte pas la présence de virus mais seulement de fragments dénaturés de virions. Ces fragments sont présents dans les fosses nasales au cours de l'infection, mais également longtemps après de sorte que très nombreuses personnes ayant développé le virus de façon asymptomatique, ou pauci symptomatique, se retrouvent comptabilisées à tort comme nouveaux cas d'infection. De plus, les polymérases engendrent naturellement des erreurs de copies de sorte qu'au-delà de 30 cycles de réplication le test va être faussement positif dans un certain nombre de cas. A 40 ou 45 cycles de réplication (comme il a été pratiqué en France en octobre et probablement jusqu'à mi-novembre 2020) le nombre d'erreurs explose de façon exponentielle, engendrant un nombre considérable de faux positifs. L'étude universitaire de Rita Jafaar et al à l'IHU Méditerranée, où la présence virale a été vérifiée par culture cellulaire des échantillons utilisés pour la PCR, montre qu'à 35 cycles seulement 3% des tests PCR positifs contiennent effectivement un virus viable. Cela se traduit par un taux de tests PCR faux positifs de 97% ! Nous sommes donc là en présence d'une manipulation dictatoriale du peuple Français que l'on a piégé de façon éhontée pour lui arracher son consentement de privation anticonstitutionnelle de liberté.

Mais revenons à nos moutons, les plasmides contiennent naturellement des sites de clivage d'enzymes de restriction dont ils sont protégés par le mécanisme général de méthylation. Des plasmides génétiquement modifiés existent qui comprennent, entre autres, de nombreux sites de clivages qui permettent des manipulations à volonté, mais également des protéines fluorescentes qui servent de marqueurs au cours des expériences pour vérifier que le plasmide a bien été intégré (transfection) par les cellules où le virus doit être exprimé. De plus des gènes de résistance aux antibiotiques présents également dans le plasmide permettent d'éliminer les cellules « non-transfectées » par ajout d'antibiotique.

Il est possible depuis 2002 de manipuler le génome complet d'un coronavirus de type SARS sans laisser de trace

Il existe des familles de plasmides qui permettent le clonage et la fusion de gènes sans laisser de trace (seamless cloning). Cette technique, qui existe depuis le début des années 2000 est appelée avec humour « No see'm », c'est-à-dire « Vous les voyez pas » (sous entendu les sites de restriction). Elle permet l'assemblage facile de protéines hybrides avec précision sans que des petits morceaux de séquences non désirés soient introduits. Yount et al. ont rapporté dès 2002 le clonage complet du  coronavirus de l'hépatite murine (d'une longueur 31 kb) par intégration de son ADNc recombinant (c'est-à-dire reconstruit à partir de fragments) dans un plasmide de ce type. Les jonctions des sites de restrictions qui étaient situées à la fin de chaque fragment d'ADNc avaient été systématiquement éliminées (par enzyme de digestion) pendant l'assemblage du génome complet, permettant d'obtenir un clone du virus sans introduire le moindre changement au niveau de la séquence de nucléotides. Le virus ainsi cloné avait gardé toute sa capacité d'infectiosité.  Cette approche avait permis d'éviter les changements au niveau de la séquence qui sont normalement associés avec la construction de l'ADNc complet d'un génome viral.

Cette méthode très puissante fait appel à des enzymes de restriction de type IIS et des sites de restriction spéciaux (Esp3I) qui disparaissent ensuite au cours de la fusion des fragments. Par exemple, en la combinant avec la PCR, il est possible d'insérer des sites Esp3I à n'importe quelle position dans un génome viral et créer un domaine variable susceptible d'être modifié à volonté par mutagenèse ciblée, par PCR ou tout simplement échangé avec une autre séquence, sans qu'il y ait la moindre preuve que des sites de restriction ont été utilisé dans les manipulations d'ADN recombinant. Au final on peut vérifier également par PCR que le virus a été exprimé correctement dans les cellules transfectées et le récolter pour le tester sur d'autres cultures cellulaires, par exemple sur des tissus de mammifères (tissus pulmonaires, etc...) voire être directement testés sur des animaux vivants comme des souris, des furets ou des primates de laboratoire.

Finalement, il faut comprendre qu'une mutation ponctuelle dirigée effectuée par PCR sur un virus entièrement cloné sans modification de séquence dans un plasmide ne laisserait pas de trace.

On peut également échanger à l'intérieur d'un gène une séquence complète d'ADN sans laisser de traces à condition qu'il existe naturellement dans le génome du virus, au préalable, des sites de clivage par enzymes de restriction en amont et en aval de la séquence que l'on désire manipuler. Cela arrive fréquemment (voir partie 3 du chapitre) mais pas absolument n'importe où. Par contre, il est parfaitement possible d'introduire artificiellement par PCR un site de clivage dans une zone inter-gène ou même à l'intérieur d'un gène en repérant habilement des endroits où des mutations synonymes le permettent, de sorte à préserver l'intégrité de la composition en acides aminés. Mais cela n'est pas absolument nécessaire non plus car, une fois la manipulation effectuée les sites de clivage peuvent de toute façon être effacés par mutation ponctuelle dirigée par PCR de la même façon qu'ils ont été introduits. Évidemment, tout cela demande un travail supplémentaire mais reste très possible dans un temps raisonnable. Quant aux sites de restriction qui relient l'ADNc au plasmide, ils sont situés avant le codon d'initiation de la traduction (AUG) à l'extrémité 5' et après le codon stop (UAA, UAG, ou UGA) à l’extrémité 3' de sorte qu'ils n'apparaissent pas dans le produit génétique final.

L'insertion artificielle de sites de clivages est nécessaire lorsque l'on veut substituer une fraction de séquence avec une autre entièrement synthétique par ce qu'on est limité par une longueur n'excédant pas 100 à 200 nucléotides. Le rendement et le taux d'erreurs générées par la synthèse chimique nucléotide par nucléotide ne permet pas d'aller au delà. Il faut donc introduire, par une série de mutations ponctuelles, effectuées par PCR, des sites de restriction encadrant très précisément la région de la séquence cible des manipulations. Par exemple, dans les travaux sur le SARS-Cov les chercheurs de l'Institut de virologie de Wuhan ont artificiellement inséré des sites de restrictions autour du motif de liaison (RBM, long de 213 nt) au récepteur ACE2 pour l'étudier. Comme le pointe Li Meng Yan, la chercheuse de Hong-Kong réfugiée aux USA, deux sites de restriction encadrent également très précisément le RBM (216 nt) du SARS-Cov2 (voir chapitre suivant) ce qui pose question.

Toutes ces techniques permettent à l'heure actuelle la création et la manipulation complète d'un génome viral dans un intervalle de temps de l'ordre de quelques mois à une année, selon la capacité du laboratoire et le nombre de laborantins y travaillant. Elles ne laissent pas forcément de traces au contraire de ce que des chercheurs de l'Institut Pasteurs prétendent parfois à leurs interlocuteurs candides. Cela a conduit à l'élaboration de recettes bien établies et les techniques fonctionnent parfaitement en routine. La compétence humaine nécessite une bonne formation technique en microbiologie, mais surtout de la minutie et de la patience dans l'application rigoureuse des recettes. Ces qualités indispensables conviennent parfaitement aux jeunes femmes que l'on trouve en très grand nombre comme techniciennes, chercheurs et savantes émérites dans ce domaine de la science.

Il a fallu 5 à 6 décades de recherche et de génie scientifique pour découvrir et comprendre les mécanismes moléculaires essentiels du vivant et leurs applications. De façon générale, cette connaissance et les possibilités qui en découlent (en mal comme en bien), par exemple en terme de dépistage et de vaccination, échappent au grand public qui ne perçoit que confusément ce qui se passe. Le grand danger est de croire que la science du vivant peut se réduire de façon technocratique à un ensemble d'actions et de réactions sur un mode binaire (on-off) entièrement contrôlable. Cet état d'esprit a conduit le gouvernement français, sous influence des puissances financières, à la déraison au cours de l'épidémie. Le degré de complexité est tel que les journalistes sont incapables de mener correctement une interview dans ce domaine. Ils n'ont pas d'autre choix que de suivre la doxa imposée par les chefs de rédactions en symbiose intellectuelle avec les cercles fermés du pouvoir financier.

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